当前位置： 失血性休克 > 失血性休克指南 > 实验研究外源性一氧化碳后处理对失血性休克
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作者
张立民,孙文波,李睿
（医院麻醉科）
张冬雪
（医院老年内科）
摘要
目的 探讨外源性一氧化碳（CO）后处理对失血性休克后大鼠平衡能力的改善以及对小脑皮质内细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）的影响。方法 雄性SD大鼠60只,体质量(~)g,根据随机数字表法,将大鼠分为5组（n=12）,分别为对照组（Sham组）、失血性休克组（H组）、失血性休克+CO后处理组（HC组）、PD+失血性休克+CO后处理组（PHC组）、PD+失血性休克组（PH）。失血性休克通过股静脉放血使平均动脉压为（30±5）mmHg维持60min建立模型,再将收集的血液回输至大鼠体内达到初始血压水平作为复苏,必要时输注生理盐水;将大鼠置于含有10mL/LCO的玻璃箱内3h作为外源性CO后处理;ERK1/2阻断处理为放血前1h向脑室内注射30μL的ERK1/2抑制剂PD（30μmol/L）;对照组只进行股静脉、股动脉穿刺置管和脑室内等量生理盐水注射。采用气相分析法测定小脑皮质中CO含量,采用杠杆秤和倾斜测试评价大鼠的平衡能力,采用HE染色法测定嗜酸性浦肯野细胞数量,采用TUNEL法测定神经元凋亡率,采用免疫蛋白印迹法测定磷酸化ERK1/2、总磷酸化ERK1/2、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果 与Sham组比较,H组小脑皮质内CO含量增加,神经细胞凋亡率和嗜酸性浦肯野细胞数增加,杠杆秤和倾斜测试的合格率下降,磷酸化ERK1/2水平升高,Bcl-2/Bax比值下降（P0.05）;与H组比较,HC组小脑皮质内CO含量增加,神经细胞凋亡率和嗜酸性浦肯野细胞数减少,杠杆秤和倾斜测试的合格率升高,磷酸化ERK1/2水平升高,Bcl-2/Bax比值升高（P0.05）;与HC组比较,PHC组神经元凋亡率和嗜酸性浦肯野细胞数增加,杠杆秤和倾斜测试的合格率下降,磷酸化ERK1/2水平降低,Bcl-2/Bax比值下降（P0.05）。结论 外源性CO改善失血性休克大鼠平衡能力的机制,与增加小脑皮质内神经细胞ERK1/2磷酸化水平,降低小脑皮质神经细胞凋亡密切相关。
一氧化碳;缺氧;小脑皮质;细胞凋亡;后处理
随着当今医学的快速发展,使得神经外科、心脏外科和大血管外科手术的“手术禁区”不断缩小，同时也使得严重创伤患者的抢救成功率得以增长。然而,不管是“禁区”手术还是严重创伤,长时间的体外循环、大血管阻断或失血性休克所造成的围术期缺血再灌注损伤,特别是神经系统的不全缺血再灌注损伤,是造成患者早期死亡和远期预后不良的主要原因[1]。一氧化碳（CO）是正常生理以及病理生理状态下的重要信号分子,具有明显的抗炎特性和细胞保护作用,在心血管系统、炎症治疗以及器官移植中得到了广泛的研究[2]。CO的细胞保护作用可能与增加心肌细胞及神经细胞中的细胞外信号调节激酶1/2(extracellularregulatedproteinkinase1/2,ERK1/2)磷酸化水平相关[3-4]。本研究拟通过失血性休克模型模拟在体不全脑缺血再灌注损伤,以探讨外源性CO对大鼠小脑不全缺血再灌注后平衡能力的影响及其机制,为临床研究提供依据。
1 材料和方法
1.1
材料
清洁级雄性SD大鼠60只,9~10周龄,体质量(~)g,由医院中心实验室提供,根据随机数字表法,将大鼠分为5组（n=12）,分别为对照组（Sham组）、失血性休克组（H组）、失血性休克+CO后处理组（HC组）、PD+失血性休克+CO后处理组（PHC组）、PD+失血性休克组（PH）。其中H组、HC组、PHC组和PH组大鼠通过放血法进行失血性休克模型制作,HC组、PHC组大鼠在失血性休克后行CO后处理,PHC组和PH组在失血性休克前行PD脑室注射。
1.2
方法
1.2.1 失血性休克模型制作 腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）（Sigma公司）,待麻醉满意后,将大鼠置于加温毯并固定,建立心电监护和体温监测（迈瑞生物医疗电子股份有限公司）,体温维持在（37±1）℃。行左侧股动脉和股静脉穿刺并置管,分别进行直接动脉压力监测和放血。测定基础平均动脉压（meanarterialpressure,MAP）后,开始从左侧股静脉放血,在15min内将MAP稳定在30mmHg,将血液储存在预先肝素化的注射器中（10U/mL）（辰欣药业股份有限公司）,通过间断放血或回输血液,使MAP维持在（30±5）mmHg保持60min,60min后将收集到的血液在15min内通过左侧股静脉全部回输至大鼠体内。如果回输血液结束后仍未达到基础MAP,则通过输注适量的生理盐水进行调整。整个失血性休克过程保持大鼠自主呼吸。Sham组只进行股动脉和股静脉穿刺置管。
1.2.2 CO后处理 大鼠复苏成功后,立即置于温度控制为25℃的玻璃箱内,以10L/min的速度通入含有10mL/LCO（ppm）的混合空气,维持CO的浓度为ppm。通过CO气体监测仪（ModelEC-,RikenKenki公司）监测玻璃箱内的CO浓度,置入时间为3h。
1.2.3 PD脑室注射 将大鼠固定在脑立体定位仪（STA-,BAS公司）上,以前囟为标志,自该点向后1.0mm,旁开1.5mm钻孔,微量注射器注射PD溶液30μL（30μmol/L,批号:S,Selleck公司）,注射时间为2min,留针时间为30s。其中PD使用MDMSO（Selleck公司）溶解,生理盐水稀释为30μmol/L。Sham组、H组和HC组只注射含等量DMSO的生理盐水30μL。
1.2.4 脑组织中CO的浓度测定 每组随机选取3只大鼠,失血性休克复苏后3h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,用生理盐水经左心室-主动脉灌注,待右心耳流出的液体清亮后,在冰上迅速取出小脑组织,小脑皮质匀浆,取1mL加入到含有3mL苯二甲酸二甲酯（pH4.01）和0.5mL铁氰化钾的真空管中,充分振荡混匀后,抽取1mL气体加入到10mL真空管中,使用GC-8A气相分析仪（Shimadzu公司,日本）测定小脑皮质内的CO浓度[5]。
1.2.5 平衡能力测定 每组取3只大鼠,失血性休克复苏后15d行平衡能力测定。（1）杠杆秤实验:将大鼠放置在漂浮于水面上的一块宽为1.5cm的窄木块上,如果大鼠可以持续在木块上保持45s以上,则认为大鼠此项实验合格（标准来源于9~10周龄对照组大鼠能够维持45s以上）;（2）倾斜实验:将大鼠放置在一块倾斜度为45°的宽木板上,以5°每10s的速度倾斜,直至80°,如果大鼠可在75°的水平停留10s以上,则认为此项实验合格（标准来源于9~10周龄对照组大鼠能够在75°维持10s以上）。
1.2.6 组织病理学检查 每组取3只大鼠,失血性休克复苏后15d,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,用生理盐水经左心室-主动脉灌注,待右心耳流出的液体清亮后,迅速灌注40g/L多聚甲醛,直至动物呈僵硬状。取出小脑组织后放入40g/L多聚甲醛中后固定48h,用于组织病理学检查。脑组织石蜡切片常规HE染色,光镜下盲法计数嗜酸性浦肯野细胞数量,计数5个高倍视野,取其平均值,计算嗜酸性浦肯野细胞占总浦肯野细胞的百分比;脑组织石蜡切片水化后,根据TUNEL试剂盒说明书,行TUNEL染色,参照试剂盒(Roche公司,瑞士)说明书进行操作,碘化丙啶（PI）标记细胞核,荧光显微镜下进行观察,计算TUNEL染色阳性细胞占总细胞的百分比,计数5个高倍视野,取其平均值,即为神经元凋亡率。
1.2.7 蛋白免疫印记检测 每组取3只大鼠,失血性休克后6h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,用生理盐水经左心室主动脉灌注,待右心耳流出的液体清亮后,在冰上迅速取出小脑组织,加入细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（上海碧云天生物有限公司）,三者比例∶1∶1,充分研磨使组织细胞裂解。4℃下g离心30min,取上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物有限公司）测定总蛋白浓度。50μg蛋白质上样后60g/LSDS-PAGE中电流恒定进行电泳,电压恒定湿转至PVDF膜,50g/L脱脂奶粉室温封闭1h后,TBST洗膜,加入兔抗大鼠总ERK1/2、磷酸化ERK1/2、Bcl-2和Bax多克隆抗体（1∶,Abcam,美国）,4℃过夜孵育,TBST洗膜3次,每次10min,山羊抗兔二抗（1∶0,武汉博士的生物制剂有限公司,中国）25℃1h孵育,TBST洗膜3次,每次10min,ECL发光,以GADPH作为内参照[6]。
1.2.8 统计学分析 实验数据采用SPSS11.5进行统计分析,计量资料采用x±s,组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,两两比较采用t检验。以P0.05为差异有统计学意义。
2 结果
与Sham组比较,H组小脑皮质内CO含量增加,神经细胞凋亡率升高,嗜酸性浦肯野细胞阳性率增加,杠杆秤和倾斜测试合格率下降,磷酸化ERK1/2水平升高,Bcl-2/Bax比值下降（P0.05）;与H组比较,HC组小脑皮质内CO含量增加,神经细胞凋亡率下降,嗜酸性浦肯野细胞阳性率降低,杠杆秤和倾斜测试合格率明显升高,磷酸化ERK1/2水平升高,Bcl-2/Bax比值升高（P0.05）;与HC组比较,PHC组小脑皮质神经细胞凋亡率升高,嗜酸性浦肯野细胞阳性率增加,杠杆秤和倾斜测试合格率明显下降,磷酸化ERK1/2水平降低,Bcl-2/Bax比值下降（P0.05）;与H组比较,PH组小脑皮质区内神经细胞凋亡率升高,嗜酸性浦肯野细胞阳性率增加,杠杆秤和倾斜测试合格率明显下降,磷酸化ERK1/2水平降低,Bcl-2/Bax比值下降（P0.05）;与PHC组比较,PH组小脑皮质区内神经细胞凋亡率升高,嗜酸性浦肯野细胞阳性率增加,杠杆秤和倾斜测试合格率明显下降,磷酸化ERK1/2水平降低,Bcl-2/Bax比值下降（P0.05,表1,图1-4）。
表1 五组大鼠小脑皮质内CO含量、杠杆秤测试合格率、倾斜测试合格率、嗜酸性浦肯野细胞阳性率、神经细胞凋亡率、磷酸化ERK1/2比值和Bcl-2/Bax比值的比较(n=12,x±s)
aP0.05vsSham;cP0.05vsH;eP0.05vsHC或PH.
图1 五组大鼠小脑皮质嗜酸性浦肯野细胞的比较（箭头标注的为嗜酸性浦肯野细胞,×,标尺为nm）
图2 五组大鼠小脑皮质TUNEL阳性细胞的比较（×,标尺为nm）
图3 五组大鼠小脑皮质内磷酸化ERK1/2和总ERK1/2表达的比较
图4 五组大鼠小脑皮质内Bcl-2和Bax表达的比较
3 讨论
本研究根据既往文献报道[7],采用失血性休克模型模拟不全脑缺血再灌注损伤的病理生理过程。与单纯夹闭双侧颈动脉模型比较,失血性休克模型是临床中常见的导致不全脑缺血再灌注损伤的原因之一,此模型还能够研究失血性休克造成的其他脏器不全缺血再灌注后释放的炎症因子可能对中枢神经系统造成的影响,更符合正常病理生理过程,是较为理想的研究不全缺血再灌注的动物模型[8]。
小脑是脑缺血再灌注损伤中易受损的重要靶器官之一,特别是在失血性休克后,小脑功能受损常造成患者短期死亡和长期预后不良[9]。小脑皮质中的浦肯野细胞对缺氧极其敏感,在缺氧后可表现为嗜酸性增强[10-11]。本研究结果显示,失血性休克大鼠小脑皮质内的嗜酸性浦肯野细胞阳性率增加,神经细胞凋亡率增加,大鼠的平衡功能明显受损,表明失血性休克可造成小脑浦肯野细胞的缺氧和凋亡,显著影响小脑结构与功能。
CO后处理能够减轻失血性休克模型中大鼠肺Ⅱ型表皮细胞的凋亡[12],CO还能够减轻局灶性缺血再灌注大鼠模型中海马区神经细胞的凋亡[13]。本研究发现,外源性CO后处理能够明显升高小脑组织中的CO含量,同时明显减少失血性休克后大鼠小脑皮质内的嗜酸性浦肯野细胞的阳性率,降低浦肯野细胞的凋亡率,改善大鼠的平衡能力。以上结果表明,外源性CO减轻小脑不全缺血再灌注损伤的机制可能与抑制小脑皮质神经细胞凋亡密切相关。
ERK1/2作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）家族的重要成员,能够调控多种抗凋亡因子和凋亡因子的表达,在细胞增殖和凋亡中发挥着重要作用,如上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax的表达水平[14]。外源性CO后处理能够增加肾小球内皮细胞和肾小管上皮细胞内ERK1/2的磷酸化水平,在肾缺血再灌注模型中发挥的保护功能[15]。本研究结果表明,外源性CO后处理能够显著增加ERK1/2的磷酸化水平,上调Bcl-2/Bax比值。PD能够直接透过细胞膜,通过特异性结合ERK1/2上游MAPK激酶（MEK）,阻止ERK1/2在Ser/Ser位点的磷酸化[16]。在本研究中,CO后处理的失血性休克大鼠接受PD脑室预注射后,ERK1/2的磷酸化水平在小脑皮质内被明显抑制,导致嗜酸性浦肯野细胞的数量显著增加,神经细胞的凋亡率显著升高,Bcl-2/Bax比值降低。以上结果表明外源性CO对小脑不全缺血再灌注损伤的保护作用,可能与ERK1/2信号通路相关。细胞外信号调节激酶5（extracellularsignalregulatedkinase,ERK5）是近年来新发现的MAPK家族的成员,对细胞生存、增殖和分化有着重要作用[17],已有研究表明PD也能够抑制ERK5的磷酸化表达[18],而在本研究中缺少对PD作用前后ERK1/2和ERK5的表达比例的研究,以证实ERK5磷酸化在失血性休克中的作用,我们将在未来的实验中进一步研究。
既往研究[19]发现上调大鼠皮质神经元中的磷酸化ERK1/2能够减轻神经细胞在缺血再灌注中的损伤,同时还有研究显示七氟醚可通过增加神经胶质细胞中磷酸化ERK1/2水平,减少胶质细胞的凋亡,改善神经功能和预后[20]。本研究发现CO可能通过上调小脑神经细胞中磷酸化ERK1/2表达,减轻缺血再灌注损伤,进一步为ERK1/2在神经系统缺血再灌注损伤中的重要作用提供了理论依据。但由于本研究为在体动物实验,并未区分神经元和神经胶质细胞中磷酸化ERK1/2的表达,因此需要进一步的离体细胞实验进行验证。
综上所述,外源性CO改善失血性休克大鼠平衡能力的机制,与增加小脑皮质内神经细胞的ERK1/2磷酸化水平,上调Bcl-2/Bax比值,降低小脑神经细胞凋亡密切相关。
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年6月30日
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参考文献详见《麻醉安全与质控》杂志官方网站
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