当前位置： 失血性休克 > 失血性休克心率 > 下胸段硬膜外阻滞对失血性休克复苏大鼠肠
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肖锦容 蔡宇平 郑婉静 许玉城 吴黄辉 陈国忠 王丽萍
福州，中国医院，福建医科大学福总临床医学院，医院，安徽医科大学福总临床医学院麻醉科（肖锦容、蔡宇平、郑婉静、许玉城、吴黄辉、陈国忠、王丽萍）
国际麻醉学与复苏杂志,,38(12):-.
DOI：10./cma.j.issn.-..12.
基金项目：国家自然科学基金青年项目（）；
福建省自然科学基金面上项目（J）；
全军医学科技青年培育项目（14QNP）；
医院医学科技研究计划（J01）
ORIGINALARTICLES
失血性休克是威胁创伤和手术患者生命的严重病理生理状态。由于肠黏膜具有高代谢性以及特殊的绒毛微血管结构，对缺血/缺氧极为敏感；复苏后，重新得到血供的肠黏膜经历缺血/再灌注，损害持续加重，肠道通透性增加导致细菌移位和LPS吸收，可诱发全身炎症反应综合征甚至多器官功能障碍综合征，病死率高达50%~90%。由于肠道被认为是休克复苏后发生多器官功能障碍的始动器官，保护肠黏膜及其上皮的屏障功能成为降低失血性休克复苏后病死率的重要措施。
硬膜外阻滞是常用的麻醉和术后镇痛方式，研究表明，不同节段硬膜外阻滞是围手术期心、脑、肠等器官的重要保护措施，其中，下胸段硬膜外阻滞能保护低氧血症或内毒素血症家兔的肠上皮屏障（intestinalepithelialbarrier,IEB）。因交感神经纤维在肠道黏膜层几乎没有分布，故多数研究揭示下胸段硬膜外阻滞主要通过改善肠道微循环的血流灌注或减轻肠黏膜的炎症反应，间接发挥对IEB的保护作用。然而，肠道自身拥有一个完整的神经网络——肠神经系统，其中的肠胶质细胞（entericglialcell,EGC）除具有对肠神经元的营养、支持作用外，其活化还可增强IEB的耐受性，是调控IEB稳态的重要因素。目前已有诸多关于下胸段硬膜外阻滞对脓毒症或肠缺血/再灌注损伤动物模型IEB保护作用的研究，但并未涉及EGC在其中的变化和作用，故本实验拟观察并探讨下胸段硬膜外阻滞对失血性休克复苏大鼠IEB的保护及其对EGC活化程度的影响。
1 材料和方法
1.1 动物选择
健康成年雄性SD大鼠，体重~g。自由进食饮水，室温23℃，湿度55％，12h光照，适应环境1周后进行实验。
1.2 下胸段硬膜外置管模型的建立
大鼠腹腔内注射10%水合氯醛3ml/kg麻醉后，俯卧位固定。以髋结节平L6棘突体表标志，向上定位L4棘突并标记。颈部和背部剔毛，消毒铺巾。以L4棘突为中心行纵行切开皮肤，钝性分离棘突及椎板附着肌肉组织，用7号注射器针头挑开少许L3~L4之间的韧带组织，可见白色硬脊膜，直视下将PE-10管（外径0.61mm，内径0.28mm，深圳瑞沃德生命科技有限公司）置入硬膜外腔并向头侧置管1.5cm，行液体负压试验以避免导管误入硬膜下或蛛网膜下腔。用缝线环绕导管固定于肌层，经皮下隧道将导管另一头固定于颈部，肝素封管并用无菌医用胶带封闭导管尖端，逐层缝合后涂抹金霉素眼膏预防感染，术毕单笼饲养。
下胸段硬膜外腔置管成功的标志：①大鼠苏醒后活动正常；②隔天以微量注射器经导管注射1%利多卡因μl/kg，大鼠出现双下肢松软，腹部松弛，腹背部痛觉减退且未出现全脊髓麻醉的现象可明确导管在位；③实验结束后所有大鼠硬膜外注射1%亚甲蓝溶液μl/kg后尸检，导管位于硬膜外腔且染色范围在T4以下视为置管成功。满足前述两项的大鼠于术后第3天进行随机分组。
1.3 动物分组
72只置管成功的SD大鼠，按随机数字表法分为4组（每组18只）：假手术组（S组）、休克复苏组（C组）、休克复苏+硬膜外注射生理盐水组（N组）、休克复苏+硬膜外注射罗哌卡因组（T组）。S组仅行左侧颈总动脉和颈外静脉置管，其余3组大鼠制备压力控制型失血性休克复苏模型。T组于放血前30min用微量注射器以6μl/s的速率硬膜外注射0.%罗哌卡因（生产批号：H20105，阿斯利康制药有限公司）μl/kg，N组以同样速率硬膜外注射与罗哌卡因等体积生理盐水。
1.4 失血性休克复苏模型的建立
大鼠腹腔内注射10%水合氯醛3ml/kg麻醉后，仰卧位固定，保留自主呼吸并予自制氧罩吸氧（氧流量5L/min，FiO%）。颈部皮肤消毒后行颈正中切口，暴露左颈总动脉，置入24G套管针，经过三通阀连接PowerLab/8SP多道生理记录仪换能器和储血器（由10ml注射针筒及2m延长管组成并以4U/ml肝素的生理盐水预充），分别用于血流动力学监测和血液储存。行同侧颈外静脉插管后注射肝素钠U/kg行全身肝素化。45min后将三通阀拨至储血器，经颈总动脉缓慢放血，15min内使MAP降至40mmHg，并通过间断抽取或回输少量血液使MAP维持在35~45mmHg。将储血器浸泡于37℃左右的温水中，大鼠下垫动物恒温毯，体温测定探头插入大鼠直肠内监测肛温，使大鼠肛温维持于37℃左右。记录休克60min时的总放血量，并于15min内经颈静脉回输全部自体抗凝血和等量生理盐水进行复苏。复苏后MAP在80mmHg以上并维持15min视为复苏成功。复苏后60min予以拔除动静脉置管，结扎止血并逐层缝合后回笼，笼内敷料充足并以灯源照射保温直至大鼠苏醒。
1.5 生存分析
每组随机选取10只大鼠，记录自复苏成功72h内大鼠的生存时间，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
1.6 血流动力学监测及血气分析
分别记录动静脉置管稳定15min（T0）、硬膜外注射30min（T1）、休克30min（T2）、休克60min（T3）、复苏30min（T4）、复苏60min（T5）时间点大鼠的MAP和HR，其中T1~T3为休克期，T3~T5为复苏期；并于T0、T3和T5三个时间点分别采集动脉血0.1ml进行血气分析，并补充0.2ml生理盐水。
1.7 门静脉血LPS及湿/干比（wet/dryratio,W/D）的检测
复苏后3h各组剩余8只大鼠经腹腔注射过量戊巴比妥钠（65mg/kg）处死，取门静脉血1ml采用改良过氯酸法预处理血浆、偶氮显色法鲎试验定量测定LPS（上海伊华临床医学科技公司），以评价肠屏障功能。距离回肠末端5cm处取约1cm肠段，剪去多余脂肪组织，除去肠内容物并用滤纸吸去多余水分后测量肠湿重，然后置入60℃烤箱（上海贺德实验设备有限公司）烘烤72h达恒重即为肠干重，计算W/D值，以评价肠组织水肿程度。
1.8 肠组织病理学变化及损伤评分
取距回盲部6cm处1cm肠段，用10%中性甲醛液固定24h以上、脱水、常规石蜡包埋，5μm切片H-E染色，光镜下观察肠黏膜结构变化。按Chiu氏六级评分法评价肠黏膜损伤程度，评分标准如下：0分为正常绒毛；1分为绒毛顶端上皮下损伤，Gruenhagen间隙增大；2分为上皮下间隙扩张，上皮与固有层呈中度分离；3分为上皮下间隙进一步扩张，上皮层与固有层间呈大量分离，偶有绒毛顶端裸露；4分为绒毛破损裸露，伴固有层毛细血管扩张；5分为固有层破坏、不完整、溃疡和出血。评分由同一位不明实验分组且有经验的病理科医师进行，显微镜下任选5个非重叠视野，取评分的平均值用于统计。
1.9 Westernblot检测EGC标记物胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein,GFAP）和紧密连接蛋白Occludin的表达
冰上快速分离距回盲部7cm处1cm肠段，去除肠内容物，加入细胞裂解液，冰上裂解30min，r/min，4℃离心5min（离心半径为8cm），取上清液，2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠法测定蛋白浓度。取20μg蛋白在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，将分离后蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h。封闭好的聚偏二氟乙烯膜用TBS洗涤（10min×3次），分别加入兔抗GFAP一抗、兔抗Occludin一抗和兔抗β-actin一抗，4℃孵育过夜后用TBS洗涤（10min×3次），加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，室温孵育2h后用TBS洗涤。化学发光法检测，显色，曝光，显影定影。采用QuantityOne软件分析各条带的灰度，以与β-actin条带灰度的比值反映GFAP和Occludin的表达水平。
2 结 果
2.1 失血量及脊柱节段亚甲蓝染色分布
C组、N组、T组大鼠失血量比较，差异无统计学意义，3组大鼠均复苏成功。实验结束后经硬膜外注射与罗哌卡因等量亚甲蓝溶液（速率为6μl/s），尸检发现脊柱节段亚甲蓝染色上、下限组间差异无统计学意义（P＞0.05），染色范围T6［T5，T7］~L4［L3，L4］，所有大鼠亚甲蓝染色上限最小值为T4（表1）。
2.2 生存分析
S组大鼠复苏后72h生存率为%，C组和N组分别为0和10%，T组为30%。S组、C组、N组和T组的中位生存时间依次为72、9、14、32h。与S组比较，其余3组大鼠复苏后生存率显著降低（P0.05），与C组和N组比较，T组大鼠生存率及中位生存时间均明显改善（P0.05）；C组和N组大鼠生存率比较，差异无统计学意义（P0.05，图1）。
2.3 血流动力学
各组大鼠T0时MAP及HR差异均无统计学意义。T1时T组大鼠MAP略降低，但与其他各组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而HR显著低于S组和N组（P0.01）。T2和T3时T组MAP显著低于S组（P0.01），而与C组、N组差异无统计学意义；HR则显著低于其余3组（P0.05）。各组休克大鼠T2和T3时间点MAP差异无统计学意义（P＞0.05），而T组大鼠HR均显著低于其余3组（P0.05，图2）。
2.4 血气分析
各组大鼠T0时pH、乳酸和Hct水平差异无统计学意义。与S组比较，其余3组T3时pH、Hct降低，乳酸水平增高，差异均有统计学意义（P0.05）；与C组、N组比较，T组T3时pH和乳酸水平改善，差异均有统计学意义（P0.05），而Hct组间差异无统计学意义。与S组比较，其余3组复苏后T5时乳酸水平增高，Hct降低，差异均有统计学意义（P0.05）；T5时C组、N组pH较S组显著降低（P0.05），而T组pH与S组比较，差异无统计学意义；与C组、N组比较，T5时T组pH和乳酸水平改善，差异均有统计学意义（P0.05），而Hct组间差异无统计学意义（图3）。
2.5 肠W/D和门静脉血LPS检测结果
与S组比较，其余3组大鼠肠W/D和门静脉血LPS水平均显著增高（P0.01）；与C组、N组比较，T组W/D和LPS水平降低，差异均有统计学意义（P0.05，图4）。
2.6 光镜下肠黏膜形态学观察与评分
S组绒毛排列整齐，腺体正常，上皮下间隙无扩大，固有层无水肿（图5A）；C组和N组表现为绒毛上皮细胞脱落，上皮下间隙扩张，上皮与固有层分离，固有层充血或出血，腺体受损，大量中性粒细胞浸润（图5B和5C）；T组绒毛顶端上皮轻微损伤，上皮下间隙轻度增大，固有层及腺体轻度水肿（图5D）。与S组比较，其余3组肠黏膜Chiu氏评分显著增高（P0.01）；与C组、N组比较，T组Chiu氏评分降低，差异均有统计学意义（P0.05，图5E）。
2.7 Westernblot检测EGC标记蛋白GFAP和紧密连接蛋白Occludin的表达结果
与S组比较，其余3组GFAP表达均显著增加（P0.05），且T组表达增加显著高于C组、N组（P0.05）（图6A、图6B）。与S组比较，其余3组Occludin表达均显著减少（P0.05），但T组Occludin表达显著高于C组、N组（P0.05，图6A、图6C）。
3 讨 论
恢复有效的循环血量是失血性休克的基本治疗原则。液体复苏虽然可以改善BP、HR等指标，但内脏器官尤其是肠道由于血管内皮细胞损伤、水肿等原因而仍然持续处于灌流不足的状态，表现为乳酸堆积和酸中毒。血乳酸是明确复苏终点的良好指标，并与复苏后患者的预后密切相关。生存时间与生存率则是综合反映大鼠复苏质量的最终效应指标。本研究结果表明，下胸段硬膜外阻滞能够显著提高复苏后大鼠72h内生存率，延长其中位生存时间，且pH和动脉血乳酸水平均得到明显纠正，提示该保护作用与改善组织灌注有关。
本研究尚表明，下胸段硬膜外阻滞有利于失血性休克复苏大鼠IEB结构和功能的保护，前者表现为缓解肠道组织学水肿并减轻其病理性损伤、增加肠黏膜紧密连接蛋白Occludin的表达，后者则表现为降低门静脉血LPS水平。肠黏膜上皮是维持正常IEB结构和功能的主要执行者，完整的上皮层不仅包括肠上皮细胞，更需完整的紧密连接和其下方的黏着连接。Occludin是紧密连接中的一种4次跨膜蛋白，在一定程度上反映紧密连接和IEB的功能状态。本研究结果表明，失血性休克复苏后各组大鼠肠Occludin表达均降低，提示失血性休克可持续影响肠IEB结构完整性，而下胸段硬膜外阻滞能在一定程度上减轻Occludin表达的降低，提示是减轻IEB结构损害的有效手段。IEB结构受损后肠道通透性增加至一定程度即可引起LPS血症，诱发多种细胞因子和炎症介质的释放，引起全身炎症反应综合征甚至多器官功能障碍综合征，从而进一步加重对IEB的损伤，如此恶性循环。
有研究表明门静脉LPS水平在失血性休克复苏后即刻升高，3~6h达高峰，而肠黏膜的形态学修复在复苏后3h即开始，为了同时观察到复苏后肠黏膜典型的形态学损伤和功能的破坏，我们选择复苏后3h分别检测门静脉LPS水平并进行肠黏膜损伤Chiu氏评分。结果表明，下胸段硬膜外阻滞显著减轻复苏后大鼠肠黏膜病理性损害，从而降低门静脉LPS水平。
此外，维持正常的IEB结构和功能还有赖于肠神经系统和自主神经系统的共同调节。肠神经系统是肠道自身独特且完整的神经网络，EGC是其中数量最多的细胞，广泛参与IEB稳态的调控，促进缺血性或炎症性损伤后IEB的修复，增强IEB的耐受性。有研究表明，EGC严重破坏后可导致爆发性肠炎，表现为IEB完整性的破坏，而将EGC和单层肠上皮细胞共培养后，前者可通过调节后者紧密连接蛋白的表达，增加IEB耐受性并降低细胞旁通透性。此外，电刺激迷走神经也可通过促进EGC的活化，上调肠GFAP表达，降低肠黏膜通透性，发挥烧伤大鼠IEB的保护作用，且在烧伤后注射一种由活化的EGC释放的信号分子S-亚硝基谷胱甘肽，也可起到与迷走神经刺激相似的保护作用，提示迷走神经兴奋性的增高能促进肠EGC的活化进而保护IEB。
目前尚无直接证据表明节段性交感神经阻滞通过活化EGC发挥对IEB的保护作用，下胸段硬膜外阻滞维持IEB结构与功能完整性的机制研究多集中于通过阻滞交感缩血管纤维改善肠道微循环以减轻IEB的缺血性损伤，或通过激活迷走神经介导的胆碱能抗炎通路缓解IEB的炎症性损伤。本研究结果表明，失血性休克复苏后大鼠肠EGC活化显著上调，表现为肠GFAP表达的增加，从而促进IEB的损伤性修复；此外，由于下胸段硬膜外阻滞使迷走神经兴奋性相对增强，故T组GFAP表达量显著增高，并伴随肠黏膜紧密连接蛋白Occludin表达增高，提示下胸段硬膜外阻滞可促进IEB的修复并增强其屏障功能。
对循环功能的抑制是下胸段硬膜外阻滞主要的副作用。节段性地阻滞交感神经传出纤维，引起阻力血管和容量血管的扩张，回心血量减少，心排血量下降导致血压降低；静脉压下降使右心房压降低，通过静脉心脏反射致HR减慢。本研究采用低浓度罗哌卡因（0.%），且控制硬膜外阻滞平面在T4以下，对心脏交感神经（T1~T4）的影响小，虽然复苏后一段时间内T组HR和MAP较低，但均处于正常范围，故失血性休克复苏大鼠应用低浓度罗哌卡因行下胸段硬膜外阻滞是相对安全的。
我们在构建大鼠HSR模型前采用小剂量、低浓度的罗哌卡因缓慢硬膜外注射，这一“预处理”方式显著预防且改善了休克早期微血管痉挛引起的组织缺血性缺氧，并通过上调肠EGC的活化水平增强了IEB对休克及复苏的耐受性。然而，临床上的失血性休克往往发生突然，硬膜外阻滞这一较为复杂的“预处理”方式难以实现。尽管该动物实验离临床实践尚存在较远的距离，LTEB仍然为HSR的治疗提供了一个新的思路。
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