当前位置： 失血性休克 > 失血性休克急救 > 单克隆抗体药物的制备和应用
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摘要:
年德国学者Kohler和英国学者Milstein创建杂交瘤技术，首次成功地制备了小鼠单克隆抗体（McAb）即第二代抗体。该技术的关键步骤在于淋巴细胞之间的融合，所以称为“淋巴细胞杂交瘤技术”，由于杂交瘤经过筛选可产生针对单一抗原决定簇抗体的细胞克隆，故称为单克隆抗体技术。该技术的问世使得免疫学研究与实践发生了革命性的改观，同时还为生物学和医药学的许多领域提供了前所未有的研究工具。人们利用其可精确地识别出极为复杂的分子，测定出无法测定的物质，识别出新的细胞群体，揭示了以往未曾了解的细胞分化途径，为肿瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病等的诊断和治疗创造出令人兴奋的前景。本文就其原理、制备、应用及未来发展做介绍，揭露其研究价值和意义。文中将重点介绍单抗的制备方法和临床应用，并对其实用价值作评估。第1章前言抗体分子是生物及医学领域中用途最为广泛的蛋白质分子，至从年德国学者Behring和日本学者北里发现白喉毒素后，抗体的研究引起各领域学者的注意。早在年Hericourt等就尝试应用抗体治疗肿瘤本世纪30年代~60年代对抗体的理化性质以及对免疫球蛋白分子结构与功能的研究取得了突破性进展年，德国学者Kohler和英国学者Milstein首先提出将不能产生特异性抗体但可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，所产生的杂交瘤细胞既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体（第二代抗体）的特点将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。这一发现启发了科学家利用B细胞杂交技术成功地制备了单克隆抗体。单克隆抗体具有特异性强、效价高、均质性、少或无血清交叉反应、易于大量生产、成本低等优点，它在疾病治疗和临床实践中具有极大的应用潜力。这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法(“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。
上世纪80年代早期开始了基因工程抗体即第三代抗体的研究，至90年代初产生的抗体库技术将基因工程抗体的发展推向了高潮，使抗体制备技术进入了一个全新的时代单克隆抗体（monoclonalantibody，mAbs）是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。20世纪80年代以来，随着分子生物学的发展和抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始应用于抗体的改造，先后出现了嵌合抗体和人源化抗体。进入20世纪90年代，伴随PCR技术、抗体库技术和转基因技术的发展，使治疗性单克隆抗体最终实现了全人源抗体的制备，同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服了抗体的临床应用局限性，主要用于肿瘤、自身免疫性疾病和感染类疾病的治疗。但迄今所获得的单克隆抗体多为鼠源性，对人而言具有较强的免疫原性，在人体内可引起较强的人抗鼠抗体反应[2]从而严重地限制了单克隆抗体在人体内的应用。
随着重组DNA重组技术的发展，采用基因工程方法，在基因水平上对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，部分或全人源化的单克隆抗体技术在全世界范围内吸引了广大科技工作者的兴趣。本文就单克隆抗体原理、种类、制备、应用及未来予以详细介绍。
第2章单克隆抗体的原理和种类2.1原理
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，选择性表达出不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个表达不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，即由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。
2.2种类
单克隆抗体根据人源化程度分为鼠源性单克隆抗体、嵌合型单克隆抗体、人源化单克隆抗体和人源性单克隆抗体。
2.2.1鼠源性单克隆抗体
小鼠骨髓瘤细胞能在体内外无限增殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖采用融合剂聚乙二醇（PEG）等将这两种细胞融合成杂交瘤细胞这种杂交瘤细胞具有亲代细胞的主要特征既能在人工培养下无限增殖，又能产生特异性的抗体由于每一个被免疫的淋巴细胞只能对某个单一的抗原决定簇产生特异性抗体，因而在将其克隆化后产生的单克隆细胞系，就能产生大量单一的高纯度抗体，即单克隆抗体细胞融合培养时加入HAT（H-次黄嘌呤A-氨基喋呤T-胸腺嘧啶）选择系统，目的是保证只有杂交瘤细胞的生长融合细胞能在HAT选择性培养基上生长的原理是：在HAT系统中，A阻断了核酸合成的主要途径，这时正常细胞可以通过补救途径，由胸腺嘧啶激酶（TK）和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用T和H合成核酸骨髓瘤细胞，因缺乏HGPRT不能利用补救途径，所以在HAT系统中不能存活而骨髓瘤细胞和脾细胞的杂交细胞，从正常的脾细胞获得了HGPRT，能够存活正常脾细胞没有在体外长期生长的能力。由于单抗的应用是从体外诊断向体内肿瘤定位和治疗方向发展，故鼠源性单抗出现了难以克服的缺点，特别是在体内应用时，存在主要组织相容性抗原（MHC）和超敏反应问题。随着鼠源单克隆抗体在临床治疗中越来越广泛的应用，降低抗体免疫原性的要求也变得越来越迫切。为了克服这一问题科学家利用基因工程方法使小鼠的抗体人源化。通过构建人—鼠嵌合抗体，在一定程度上减弱了人抗鼠抗体。
2.2.2嵌合型单克隆抗体
人-鼠嵌合抗体是最早出现的人源化抗体，年Morrison[5]等人成功地构建了第一个人鼠单克隆抗体即嵌合抗体。嵌合抗体指的是鼠单克隆抗体的可变区基因被人抗体的恒定区基因通过基因重组技术所替换而编码并在合适的宿主细胞中表达而产生的单克隆抗体[6]其基本原理是抗体分子的特异性识别、抗原结合由轻链和重链可变区决定的，而异源蛋白产生的人抗鼠抗体反应的主要是抗体恒定区。将小鼠单抗恒定区用人源化恒定区代替而拼接成嵌合抗体，使其重链和轻链的可变区来自小鼠，恒定区来自人源性。简言之嵌合抗体既具有抗原结合特异性，又大大地降低了鼠单抗的异源性。嵌合抗体是基因工程抗体最早研究出来的一种抗体，在肿瘤治疗和诊断方法已被广泛的应用。虽然嵌合抗体在一定程度上减弱了人抗鼠抗体反应，但仍存在一少部分鼠源成分。这直接导致抗体被迅速清除，从而降低治疗效果。鼠单克隆抗体可变区的人源化应运而生。此外利用DNA重组技术将鼠单抗的轻链、重链可变区的基因插入含有人抗体恒定区的表达载体，转化哺乳动物细胞，即可表达出人-鼠嵌合抗体。目前，产生嵌合抗体的技术路线已比较成熟，至少5种嵌合抗体被FDA批准进入市场，单独或与化、放疗药物联合用于临床研究，在肿瘤等疾病的治疗中取得了较好的疗效。
2.2.3人源化单克隆抗体
人源化抗体[7]是在人鼠嵌合抗体的基础上进一步减少鼠源性成分，但保留鼠抗体CDR区，其余全部替换为人抗体的相应部分。这种经过改型的抗体，人源成分达90%，即通常所指的人源化抗体。人源化改造主要成果是重构抗体和表面重塑抗体。重构抗体残存少量鼠源性基因，仍能引起免疫排斥反应，存在亲和力低和特异性低于鼠源性抗体的缺点。表面重塑抗体重点在于改造或替。
年，Jones等人成功构建了第一个改形抗体[8]又称CDR移植抗体和人源化抗体，指将鼠单抗可变区中互补决定区（CDR）序列取代人源抗体相应CDR序列，重组构成既具有鼠源性单抗特异性，又保持人抗体亲和力的CDR移植抗体。迄今为止，已有多种鼠单抗通过CDR移植得到了人源化。基本原理是抗体重链和轻链的可变区主要由CDR和骨架区（FR）组成。其中可变区的6个CDR是负责识别和结合抗原的区域，它们直接与抗原接触，决定了抗体的特异性。
年由Padlan提出的与CDR移植完全不同的降低鼠源抗体免疫原性的方法。其理论依据是分析了大量鼠单抗可变区和人单抗可变区氨基酸残基的表面暴露情况，结果发现这些暴露的氨基酸残基位置和数量都非常保守，不因为种属和型别而改变。研究表面，这些暴露的氨基酸残基是鼠源可变区免疫原性的主要来源。将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中与人可变区相应的氨基酸残基改为人源的，就可以使可变区表面人源化，消除了异源性而不影响可变区的整体空间构象。
2.2.4人源性单克隆抗体
从最初的鼠源单抗技术到人源化技术，单克隆抗体在几十年的岁月中取得了突飞猛进的发展。人源化的问世使单克隆抗体基本解决了人抗鼠源性问题。但有用人源化的抗体基因均来自杂交瘤细胞。杂交瘤的这个操作过程很复杂且耗时加之利用杂交瘤技术难以制备自身抗原抗体和全人源抗体，这两大缺点成为基因工程抗体应用的绊脚石。随着科学技术的不断进步单克隆抗体进入了一个崭新的发展阶段——人源性单克隆抗体。它主要包括噬菌体抗体库技术、转基因小鼠制备人源性抗体、核糖体展示技术三部分。
噬菌体抗体库技术是迄今发展最成熟、应用最广泛的抗体库技术。它是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，它以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，该技术实现了基因型和表型的转换通过这种方式，形成获得一个具有上亿个体外方式制得的不同抗体的基因数据库，使从真实的抗原中迅速分离高度相似的同族抗体成为可能。得到的抗体可用于制备完全人源化抗体。但该技术也存在一定的缺陷，如从非免疫抗体库获得的抗体亲和力不高;免疫抗体库的库容量不足，难以涵盖一些动物抗体的多样性；在淘选过程中会出现高亲和力低拷贝的特异性噬菌体抗体的丢失等。
年,Mattheakis等建立了一种体外核糖体展示随机肽系统,利用“多肽核糖体mRNA”复合物将肽库构建在多核糖体上,借助多核糖体在体外将基因型和表型联系起来。
年，Hanes和Plukthun等在此基础上对该技术加以完善和改良，正式建立了这种体外筛选技术[15]。这项技术的基本原理是首先使用PCR技术扩增目的基因DNA文库，然后加入启动子、核糖体结合位点和茎环，并放在无细胞翻译系统中进行孵育，并且形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合体,最后用免疫学检测方法反复筛选,筛选出感兴趣的核糖体复合体，再通过RT-PCR扩增，经过多次循环过程，最终筛选出高亲和力、库容量大、特异性强的目标分子。转基因小鼠制备人源性抗体和噬菌体抗体库技术有一些共同的缺点。例如在抗体分子定向进化时除了表型筛选和基因突变之间的转换很繁琐之外，库容量也受到了限制；抗体库进行构建时，细菌转化是必经之路，因此抗体库的容量将会受到转化效率的限制等缺点。由于此技术是一个完全在体外进行转化和筛选的过程,其中的每一步包括所有的复制、扩增、转录、筛选均在体外完成，因此可以构建超大容量的库容，也可以联合使用一些特殊的PCR技术。利用核糖体展示技术可以获得高特异性、高亲和力的抗体。
第3章单克隆抗体的制备单克隆抗体制备过程通常分为注射抗原到免疫动物、细胞融合、选择性培养、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化、单克隆抗体的大量制备几个步骤。图3.1是其流程图。
3.1免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
3.2细胞融合
先用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3.3选择性培养
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
3.4杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。
3.5单克隆抗体的大量制备
单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法。
3.5.1体内诱生法
取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石蜡或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体。
3.5.2体外培养法
将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。各种新型培养技术和装置不断出现，大大提高了抗体的生产量。
第4章单克隆抗体的应用单克隆抗体可广泛地应用于临床治疗，可用于疾病诊断和疾病治疗。
4.1用于疾病诊断
①鉴定病原体，准确诊断感染性疾病；②检测淋巴细胞表面分子，以区分不同分化阶段的淋巴细胞，用于鉴别淋巴细胞；③激素类单抗可用于测定体内激素水平，判断内分泌的功能状态。④肿瘤的诊断和分型。某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性，可用于肿瘤的诊断。
4.2用于疾病的治疗
4.2.1抗肿瘤单抗
利妥昔单抗(美罗华)是第一个被批准用于临床治疗的单抗；曲妥珠单抗在乳腺癌的治疗中起着重要的作用；西妥昔单抗已被证实它对头颈部癌，非小细胞肺癌和结肠癌等多种肿瘤有效。西妥昔单抗与伊立替康联用治疗表皮生长因子受体阳性晚期结直肠癌。
4.2.2类风湿性关节炎单抗
单克隆抗体（单抗）被越来越多地用于治疗类风湿性关节炎。目前，抗肿瘤α因子药物英夫利昔单抗、阿达木单抗、阿达木单抗、戈利木单抗和利妥昔单抗被批准用于治疗类风湿性关节炎。即使单抗用于治疗类风湿性关节炎的不良反应是众所周知的，单抗浓度与副作用关系有不良记录，尤其是抗肿瘤坏死因子单抗。但是总体而言，类风湿关节炎患者接受单克隆抗体治疗应受益于个性化的剂量策略。因为单抗药代动力学和作用机制的复杂性。
4.2.3抗细胞表面分子单抗
可抑制同种免疫反应，主要用于移植排斥反应的防治。莫罗单抗是FDA批准用于肾移植患者防止异体排斥反应的第一个鼠源型McAb。此外，人-鼠嵌合抗体Basiliximab、人源化McAbDaclizumab在器官移植排斥反应的治疗上也取得了良好的效果。
4.2.4其他疾病上的应用
单克隆抗体不只在肿瘤和移植排斥反应的治疗中取得了很好的疗效，在其他疾病的治疗中也取得了一定的疗效，如单抗8H8一种抗登革热病毒核衣壳蛋白(C蛋白)的单抗对登革热病和登革热出血热/失血性休克综合征的早期诊断和治疗均有一定效果。在艾滋病的治疗上，利用基因工程手段制备的中和抗体F-B4e8(B4e8)，可以中和艾滋病病毒上的抗原表位，阻止艾滋病病毒对人体正常组织的感染对自身免疫性疾病的治疗，单抗药物能够与黏附分子、激活标记、抗原或受体靶分子结合，能在分子水平上调节免疫病理反应，从而干扰炎性反应的发生。
第5章展望单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、高效、低毒等特点，临床治疗效果十分突出，但也伴随着不良反应。由于其制作工艺（如人－鼠嵌合型抗体）和靶点非特异性分布，从而存在着过敏、心脏毒性和皮疹等副作用。另外，长期用药给机体带来的影响也不容忽视，如利妥昔单抗可导致Ｂ淋巴细胞功能低下，甚至影响体液免疫功能，并且目前单克隆抗体抗肿瘤药的分子量较大，不易进入实体瘤内部从而会影响疗效。因此，扩大单克隆抗体抗肿瘤药的临床适应证，以及解决应用中出现的新问题，已成为目前应用和研究的热点单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。在过去的30年里，从鼠源性单抗到全人源性抗体，单抗在制备技术上取得了较大的进展。单抗具有高度均一生物活性单一和与抗原结合的特异性强等优点，但是鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应，使药物的功效降低，因此单抗的人源化是单抗药物的发展趋向目前，如何提高抗体的生产效率，同时保持其优良特性，且能同时解决免疫原性这一问题，是该领域的热点和难点全人单克隆抗体是制备单克隆抗体的一种新技术。
随着抗体疗效不断提高，生产工艺不断成熟，单抗类药物必将为全球疾病患者带来更大的希望。因此，对异源性单抗进行改造以及人源性单抗的研制成为单抗研究的重要方向。相信在未来的几年里，全人源性单抗将作为一种新的产物更多地用于疾病的诊断、治疗及研究。单克隆抗体已成为现代生物技术产业的支柱之一，单克隆抗体药物在生物技术制药中占有重要地位，并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向。随着生物技术的发展，单克隆抗体制备技术的不断完善，将会研制出更多亲和力更高、疗效更好、不良反应更少、免疫原性更低的单克隆抗体，为医学界带来更大希望。尽管单克隆抗体已经取得了很大的进展，但是仍然还存在很多需要解决的问题如何寻求新的分子靶点，提高单抗导向的特异性。因此对异源性单抗进行改造以及人源单抗的研制成为单抗研究的重要方向。相信随着重组DNA技术的进一步发展，可以根据不同需要实现人人人动物人植物和动物动物等多种抗体重新组合，借助于杂交瘤细胞产生嵌合抗体重组型抗体单链抗体单区抗体全套抗体以及抗体酶，将单克隆抗体的生产效率质量以及应用提升到一个更高的水平单克隆抗体势必为全世界人们带来巨大的福音。单克隆抗体是特异性很强的药物，如果能很好地解决免疫原性等问题，则其用于治疗肿瘤或其他疾病的副作用将会比其他药物低得多。因此，单抗有着广阔的前景。随着基因组学和蛋白组学的发展，越来越多的基因及其相关蛋白的发掘，肿瘤和其他疾病相关的抗原就成为了治疗性抗体研究的主要靶标，治疗性单抗将在人类疾病治疗中扮演重要角色。在不久的将来随着宽领域技术的发展单抗的应用不仅在临床治疗中显现更好的疗效，而且将会展现更多的价值点。
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